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本试剂盒适用于从细胞和动物组织提取细胞质膜蛋白。提取过程简单方便。提取的膜蛋白不仅纯度高，保持天然活性，而且绝少交叉污染。

本试剂盒提取的蛋白为具有天然蛋白构象的活性蛋白。可用于Western Blotting、蛋白质电泳、免疫沉淀、ELISA、转录活性分析、Gel shift凝胶阻滞实验、酶活性测定等下游蛋白研究实验。

本试剂盒中不含有EDTA，与金属螯和层析等下游应用兼容。本试剂盒提取的蛋白样本含有高浓度的盐成分，不可直接用于2D电泳，需要除盐后再用于2D电泳。如下游实验需要直接用于等电聚焦、双向电泳，请使用其他货号的试剂盒。

• 使用方便，从细胞，组织中提取蛋白不需经过研磨、反复冻融、超声破碎等前处理。
  
• 提取过程简单方便，将蛋白提取的时间缩短至1小时。
  
• 含蛋白稳定剂，提取的蛋白稳定。
  
• 紫外检测蛋白浓度时，背景干扰低。
  
• 总蛋白提取液含多种有效成分，可充分释放胞浆蛋白、核蛋白和膜蛋白，又可结合释出蛋白防止沉淀。
  
• 蛋白酶抑制剂抑制了蛋白的降解，蛋白酶抑制剂配方优化。蛋白酶抑制剂混合物包含6种独立的蛋白酶抑制剂；每一种抑制剂可特异性抑制某一种或几种蛋白酶活性。该混合物优化的组成使其可以抑制几乎所有重要的蛋白酶活性。

• 蛋白酶抑制剂在2～8℃低温时是固体状态，从冰箱取出后恢复至室温或37℃短时间水浴，变成液体状态后离心至管底部再开盖。
  
• 旋帽离心管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体甩至管底，避免开盖时液体洒落。
  
• 实验过程中的所有试剂须预冷；所有器具须放-20℃冰箱预冷。整个过程须保持样品处于低温。
  
• 蛋白酶抑制剂储存期间溶液如果出现沉淀，不影响使用，溶解后正常使用。
  
• 可以根据自己实验需要加入其它蛋白酶抑制剂单品。
  
• Western实验内参可以选用Na-K ATPase。

• 细胞质膜蛋白提取
  
  • 试剂准备：
    每500μL冷的蛋白提取液A中加入5μL试剂B和2μL蛋白酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。
    注：
    ● 根据需要处理的样品数量准备蛋白提取液，蛋白酶抑制剂混合物不可以一次全部加入提取液。
    ● 加过蛋白酶抑制剂的提取液一周内未使用完，再次使用前需要再次加入蛋白酶抑制剂。
    ● 以下步骤中使用的蛋白提取液为此步配制好的含蛋白酶抑制剂的提取液。
    
  • 取5～10×10⁶个以上细胞，在4℃,500×g条件离心5分钟，小心吸取培养基，尽可能吸干，收集细胞。
    
  • 用冷PBS洗涤细胞两次，每次洗涤后尽可能吸干上清。
    
  • 细胞样品中加入300～500μL冷的试剂A，高速涡旋充分混匀。
    
  • 置2～8℃振荡30分钟。
    注：
    ● 此步骤必须在2～8℃处理，不可在室温下操作。
    ● 裂解液用量并不是一定的，请根据细胞数量实际情况调整。大约细胞样本和提取液体积比1:5～10，根据实际情况调整提取液A用量。
    ● 由于质膜蛋白含量较少，需要较多的细胞才能保证得率。
    ● 如果没有2～8℃持续振荡条件，也可直接置2～8℃冰箱静置，稍微延长处理时间，中间每隔10分钟用移液器吹打混匀即可。
    
  • 高速涡旋振荡5秒，然后在4℃,12000×g条件下离心5分钟。
    
  • 将上清吸入另一干净离心管，37℃水浴5～10分钟。
    
  • 在37℃下500×g～1000×g力离心3分钟。
    注：
    ● 此步骤必须37℃条件下离心。
    ● 如果离心机不可控温，可以不离心，延长上一步骤水浴时间，至溶液分层清晰即可。或者在室温条件下离心，缩短离心时间至1分钟。
    
  • 此时溶液分为两层，下层是膜蛋白约为30～50μL。
    注：下层为粘稠状液体。
    
  • 小心移除上层，用50～150μL冷的试剂C溶解下层质膜蛋白部分，充分混匀，即得细胞质膜蛋白。
    
  • 将上述蛋白提取物定量后分装于-80℃冰箱保存备用或直接用于下游实验。
    注：
    ● 建议用BCA法进行蛋白定量。
    ● 蛋白样品-80℃存放一年没有问题。注意不要被蛋白酶水解掉，不要被细菌污染。
• 组织样本质膜蛋白提取
  
  • 取适量组织样本用手术剪刀尽可能剪碎，加入冷的蛋白提取液A，用组织匀浆机/匀浆器匀浆至无明显肉眼可见固体，将匀浆吸入另一预冷的干净离心管。
    注：每个样大约50～100mg组织。样品较大可以相应增加提取液用量。
    
  • 按照细胞蛋白的提取方法的第5步骤往下操作即可。

• 蛋白浓度低？
  膜蛋白丰度较低，必须保证足够的细胞样品上样量才能收获足够的蛋白，在条件允许的情况下，请尽可能增加细胞量。处理部分细胞或组织样本时可能没有裂解完全，导致蛋白浓度低。只要适当延长试剂A的处理时间即可。最好在持续振荡的条件下处理，没有振荡器也可间隔几分钟用吸头吹打混匀。
  
• 用什么方法定量蛋白？
  建议用BCA法。不适合用Bradford法，因为试剂A中含有干扰Bradford法的组份，导致定量不准。如果已经进行过透析处理或者用脱盐柱改换过缓冲体系，则可以用Bradford法定量。
  
• 提取的蛋白具有活性吗？
  本试剂盒不含有离子型去垢剂组份，不破坏蛋白的结构，没有对蛋白质之间原有的相互作用的破坏，蛋白均保持其天然构象和活性。